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Ä Castry Glwadys and Delbé Lionel
Ä Licence de biologie générale Université des Antilles Guyane
faculté des sciences
Ä Travaux pratique de biochimie assuré par
Th.MARIANNE PEPIN
Ä 18 janvier 2001
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SOMMAIRE
DETERMINATION DE L’ACTIVITE CATALYTIQUE VOLUMIQUE
PREPARATION DE LA
SOLUTION DE
CUPROALCALINE ET DE FOLIN-LOWRY
ELECTROPHORESE EN
PRESENCE DE SDS
PREPARATION DU GEL DE SEPARATION A 10%
PREPARATION DU GEL DE CONCENTRATION A 5%
PROCEDE DE BRANCHEMENT DE
L'ELETROPHORESE
PURIFICATION D ‘UNE PROTEINE LE LYSOSYME
La manipulation a pour objectif la purification du lysozyme (un enzyme) à partir d’un blanc d’œuf.
On réalise par la même une électrophorèse sur gel de polyacrylamide pour mettre en évidence la présence
du lysozyme parmis les autres protéines du blanc d’œuf.
Le lysozyme représente environ 7 à 8% des protéines du blanc d’œuf et à pHi=11 , nettement supérieur à celui des autres protéine du blanc d ‘oeuf. Par conséquent la purification du lysozyme s’effectue grâce a une chromatographie échangeuse d’ions. Pour cela ,un échangeur faible de cations comme la carboxymethylcellulose est utilise car il est charge negativement. La purification s’effectue en trois étapes:
*Une phase d’absorption qui s’effectue avec un tampon a pH=10
A ce pH le lysozyme est encore charge positivement alors que les autres protéines de plus faibles pHi sont chargées négativement. Le lysozyme sera donc fixe a la carboxyméthylcellulose par interaction ionique
* Une phase de lavage qui a pour but d’éliminer les protéines libres et celles fixées non spécifiquement a la carboxymethylcellulose
* Une phase de désorption effectuée en présence de NaCl. Il y a donc au cours de cette phase compétition entre le lysozyme et les ions sodium qui finissent par se substituer au lysozyme fixe à la carboxymethylcellulose. Cette alternance est basée sur la force ionique du sodium supérieur a celle du lysozyme.
Les différentes centrifugations de la phase d’absorption et de lavage permettent d’éliminer les autres protéines chargées négativement.
Dans un deuxième temps afin de vérifier la présence du lysozyme, nous avons utilisé une solution bactérienne de Micrococcus. Les solutions protéiques en contact avec la solution bactérienne entraîne la lyse de la paroi des bacteries. En effet le lysozyme catalyse l’hydrolyse des liaison b 1-4 entre l’acide N-acetylmuramique et les résidus N-acetylglucosamine présent des les parois bactériennes. Les parois bactériennes absorbent à 450nm et leur lyse entraîne une diminution de l’absorbance ce qui permet de détermine l’activité catalytique de l’enzyme.
La troisième étape consiste à doser les protéines. Ce dosage est réalisé par la méthode colorimétrique de folin-lowry. Elles est basée sur deux réactions colorées:la réaction du biuret et la réduction de la tyrosine et du tryptophane par le réactif de folin-ciocalteu. Le maximum d’absorption du complexe coloré résultant se situe entre 650 et 700nm.Cette méthode est 100fois plus sensibles que la méthode du biuret. Les ions Cu2+ du réactif de folin en milieu alcalin par rapport à la solution cuproalcaline et la solution protéique forment un complexe cuivre protéique. Ce dernier ainsi que les résidus tyrosine et les tryptophane de la protéine réduisent les ions phosphomylobdates et phosphotungstates du réactif en dérives de couleur bleue. L’absorbance de ces solutions colorées est alors mesurée à 700nm.La concentration en lysozyme des différentes fractions est détermine à l’aide d’une courbe étalon A700nm=f(mg de protéine par tube)
Le dernier principe utilise est celui de l’électrophorèse en présence de SDS avec un gradient .L’électrophorèse est l’étude du déplacement des substances ionisées soumises à l’influence d’un champ électrique dans un milieu électrique conduisant le courant. Nous avons séparé nos fragments suivants le poids moléculaire(PM).
En effet l’utilisation d’un détergent comme le SDS charge négativement permet de dénaturer les protéines et de charger les sous unités négativement. Les molécules sont déposées du cote de la cathode et migrent vers l’anode. L’électrophorèse est réalisée sur un gel de polyacrylamide, tamis moléculaire, utilisé pour séparer de petits fragments. Les petites molécules passent mieux à travers les mailles du gel et migrent plus rapidement et plus loin.
On casse des oeufs et on ne récupère que le blanc ,dans un bêcher. Puis on procède a l’estimation du volume de blanc récupérer. Le volume de blanc est dans notre cas de 35ml.On pratique ensuite la dilution du blanc d’œuf avec du tampon tp10 ( tampon glycine NaOH,pH10; 0,1mol/l) jusqu’a un volume final de 200ml.Une fois la dilution effectuée on agite le mélange doucement afin d’éviter l’introduction d’air ,ce qui pourrait dénaturer le lysozyme. On filtre après sur laine de laine de verre.
Le volume désire pour la fraction F0 dilué au 1\4 est de 20ml.On prélève ainsi 5ml du filtrat ,que l’on complète avec 15ml de tp10.Dans un soucis de bonne conservation, cette fraction est placée dans la glace
La purification se compose de 3 phases essentielles au cours desquelles on utilise des produits facilitant chacunes de ces trois phases. Durant ces dernières nous obtiendrons des fractions comme le détails l’organigramme. La moitié de la fraction F0 es t prelevée puis additionner d’une grande quantité de carboxymethylcellulose(résine anionique) dans un tube Falcon. Le mélange est agite doucement a la main en évitant de produire des bulles. Il s’en suit 15 minutes(min) de repos ,et une centrifugation à 4°C,1500G durant 10 minutes. Suite à cette étape on récupère dans un tube à essaie le surnageant ,ce qui constitue notre fraction F0.
On poursuit la purification et l’obtention des autres fractions comme le détaille l’organigramme. Il est a note qu’un soin particulier est apporté à la centrifugation, en équilibrant le rotor de la centrifugeuse avec un tube Falcon rempli d’eau de poids moléculaire équivalent a l’autre tube Falcon contenant le mélange.
En fin de purification ,on procède à la détermination du volume de chaque fraction, puis l’on conservera l’ensemble au frais, afin de ralentir la dégradation
DETERMINATION DE L’ACTIVITE CATALYTIQUE VOLUMIQUE
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FRACTION |